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細菌素(bacteriocin)是某些細菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物[1]，某些細菌通過核糖體機制產(chǎn)生的一類具有抑菌生物活性的蛋白質(zhì)，大多數(shù)細菌素只對親緣關(guān)系較近的細菌有毒害作用，產(chǎn)生菌對其產(chǎn)生的細菌素具自身免疫性。雖然細菌素是抵抗諸如單核細胞增生李b特氏菌(L. monnocytogenes)等食品病原菌的抑菌劑，它們并不同于青霉素等抗生素；傳統(tǒng)的多肽抗生素是由細胞多酶復合體催化形成的，不存在結(jié)構(gòu)基因[2]，而細菌素由基因編碼,可以通過基因工程的手加以改造。它們的合成及作用模式與臨床使用的抗生素亦不同。此外，對抗生素顯示抗性的微生物通常不對細菌素顯示交叉抗性，且與抗生素的抗性不一樣，細菌素抗性通常不是由遺傳決定的。雖然尼生素是商業(yè)上使 用 的 唯 一 的 純 化 的 細 菌 素 ， 別 的 如 小 球 菌 素(pediocin)，已經(jīng)在食品中應用。由于食品安全問題正越來越受到國際社會的關(guān)注，來源于乳酸菌的能抵抗食品病原菌且無毒性或其它不利影響的抗菌肽的應用已經(jīng)引 起 很 大 的 關(guān) 注 。美 國 每 年 花 在 與 空 腸 彎 曲 菌(Campylobact er jejuni ) 、韋氏梭菌(Clost ridiumperfringens)、 大腸桿菌(Escherichia coli O157:H7)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、 沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有關(guān)的食品引發(fā)的疾病的費用在 6.5~34.9億美元之間[3]。隨著對含有化學防腐劑的食品消費的增多，消費者對食品安全更加關(guān)注，出現(xiàn)了對更“天然 " 或“盡量少的加工”食品更大的需求。因此，人們對天然的防腐劑細菌素產(chǎn)生了濃厚的興趣。文章以尼生素為重點對細菌素與抗生素的區(qū)別、活性細菌素分子的形成以及其在食品中的應用進行了較詳細的討論，比較了這兩種類型的分子的合成、作用模式及抵抗力和安全性。
    1 細菌素的來源及分類
    為了維持自身的生存或其生態(tài)小環(huán)境，許多真核生物形成了對抗競爭者或傳染者的抗菌防御系統(tǒng)[4]。從許多種類的真核生物中均發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的產(chǎn)生是其第一層防御，也是其先天免疫性的一部分。有時這些多肽對特定的競爭菌群起作用，有時它們的廣譜活性可作為更一般的防御機制。s菌肽通過不同的機制保護寄主，但最常見的是通過增加靶細胞膜的通透性，導致胞內(nèi)物質(zhì)的不可逆泄漏及隨后的細胞死亡。來源于真核細胞的抗菌肽具有不同程度的毒性。例如，防御素(defensins)，由人類的嗜中性粒細胞產(chǎn)生，在高濃度時對生產(chǎn)其的細胞有細胞毒素的作用。雖然從真核細胞中分離出了許多種類的抗菌肽，但它們的細胞毒素限制了其在食品中使用。
    細菌素最先發(fā)現(xiàn)于 G―菌中。大腸桿菌素由多種抗細菌蛋白組成，它們可以通過各種機制：比如抑制細胞璧的合成，增加靶細胞膜的通透性，或抑制 RNA 或DNA 的活性，殺死親緣關(guān)系較傅南婦[5]。在 G+ 細菌中，乳酸菌已經(jīng)成為抗菌肽的巨大來源庫。如前所述，由細菌產(chǎn)生的抗菌蛋白或多肽稱為細菌素(bacteriocins)。它們是核糖體合成的，能殺死親緣關(guān)系較近的細菌。由于細菌素是從諸如肉及膳食產(chǎn)品等食品(通常都含有乳酸菌)中分離得到的，它們已經(jīng)被人們不自覺地消費了數(shù)世紀。一個對乳酸細菌的40種野生型菌株的研究表明其中的35 種產(chǎn)生尼生素[6]。有超過40 個的國家允許使用尼生素，并且已經(jīng)作為食品防腐劑使用。
    人們常將細菌素與抗生素混淆。從法制的角度來說這將限制它們在食品中的應用，因為包括我國在內(nèi)躋蛭許多國家禁止抗生素應用于食品中。所以有必要正確區(qū)分細菌素與抗生素。它們的主要區(qū)別見表1，細菌素可明顯地區(qū)別于臨床抗生素，可以安全及有效地使用以達到控制食品中目標病原體生長的目的。在此以合成作用模式、抗菌譜、毒性及抵抗機制為基礎(chǔ)來區(qū)別細菌素與抗生素。
    通常將細菌素分為三或四種類型[7]。第一類(class1)細菌素稱為羊毛硫抗生素( lantibiotics)。通常第一類細菌素典型地具有19~50 多個氨基酸不等。第一類細菌素以它們的稀有氨基酸為其主要特征，如羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)，β - 甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，>氫丙氨酸(DHA)和脫氫丁氨酸(HBD)。第一類又可再分為class 1a 和class 1b。class 1a 細菌素，包括發(fā)現(xiàn)于 1928 年的尼生素(nisin)，由陽離子及疏水性多肽組成，可以在靶細胞膜上形成孔道，還含有柔性的結(jié)構(gòu)，而class 1b 類的多肽含有比較剛性的結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)于 1948 年的枯草菌素(subtilin)是一種尼生素的類似物，在12 位氨基酸殘基上與尼生素不同，亦屬于此類。class 1b 細菌素，屬于球型多肽。第二類(class II)細菌素指那些細菌生產(chǎn)的小的熱穩(wěn)定的不經(jīng)修飾的多肽，可以進一步劃分。class IIa 包括小球菌素狀的李斯特氏活性多肽，具有保守的N端序列 Tyr-Gly-Asn-Gly-Val 及在多肽N端半部有兩個半胱氨酸形成的雙硫橋鍵。class IIb 包括由兩個不同的多肽組成的細菌素，對其活性來說兩個多肽都是必需的。這些多肽的主要氨基酸系列是不同的。那些大的、熱不穩(wěn)定的細菌素組成第三類(class III)。第四類由能夠與其它大分子形成大復合-的細菌素組成，其帶正電荷及疏水性的特點致使之與粗提物中的其它大分子形成復合物。然而，到目前為止，對第一、第二類細菌素了解得較多，并且是最有可能在食品中應用的，文章將重點討論這兩類細菌素。
    2 活性細菌素及抑菌特性
    2.1 細菌素的合成
    細菌素是在核糖體中合成的。產(chǎn)生活性細菌素的因通常在操縱子簇。研究得較多的是含有產(chǎn) lantibiotic基因的操縱子。許多含產(chǎn)lantibiotic 基因的操縱子屬于class 1a。屬于 class 1b 的 mersadicin 的全部基因簇最近也已被闡明?；蚓幋a2產(chǎn)細菌素可以位于染色體，也可以在質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)位子中編碼。許多nonlantibiotics，比plantaricin、pediocin 及 sakacin 等的遺傳規(guī)律已經(jīng)被闡明。而類似情況存在于 lantibiotic 基因(結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運、調(diào)整基因等)，plantaricin 系統(tǒng)的基因也編碼若干細菌素，這些細菌素共用轉(zhuǎn)運及調(diào)整基因系統(tǒng)[8]。與細菌素不同，抗生素通常被認為是次生代謝產(chǎn)物，它不是由核糖體合成的。雖然有些抗生素如萬古霉素也是由氨基酸組成的，但它們是由酶合成的。實際上，較多抗生素是通過一種多載體含硫模板機制(amultiple-carrierhiotemplate mechanism)合成的，在那里多肽合成酶裝配氨基酸以形成抗生素分子[9]。因為細菌素是由一個結(jié)構(gòu)基因編碼的，使得活性位點以及結(jié)構(gòu) - 功能的關(guān)系可以簡單地通過基因工程加以測定。而不象抗生素那樣，需通過化學方法合成或因其基因工程的復雜性致使涉及更多的基因。
    2.2 轉(zhuǎn)譯后修飾形成活性細菌素分子
    雖然細菌素由核糖體合成，必需經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾才具有活性。編碼修飾促酶的基因通常與結(jié)構(gòu)基因緊連。Lantibiotics 經(jīng)過最廣泛的修飾。LanB 是一種跨膜蛋白質(zhì)，由lantibiotic 生產(chǎn)者轉(zhuǎn)錄，且在運出細胞之前經(jīng)酶修飾。LanC 則參與 lantibiotics 噶蠣鴨的形成 。
    Lantibiotics 合成的一個特點是存在一個 N 端前導多肽( l ead er pept i de) ，接著它的是一個 C 端多肽前體(propeptide)。前導多肽(leader peptide)最初被認為是作為在轉(zhuǎn)錄之后修飾涉及的酶的識別位點。使用未經(jīng)修飾的多肽前體(propeptide)的實驗表明它們(多肽前體)也能夠被識別及修飾。Lantibiotics 在轉(zhuǎn)錄之后的廣泛修飾包括若干稀有氨基酸的形成。在 lantibiotics 中發(fā)現(xiàn)12 種以上的稀有氨基酸 ，Nonlantibiotics 的多肽前體(propeptide)也通過前導系列的刪除而被修飾[8]。這些修飾對于細菌素的分泌及橫e細胞膜的遷移是必要的。
    2.3 細菌素的免疫性
    細菌素與抗生素的區(qū)別在于生產(chǎn)細菌素的細胞對其產(chǎn)物(細菌素)具有免疫力。細菌素中編碼免疫蛋白的基因靠近其結(jié)構(gòu)及調(diào)整基因。通常細菌素的結(jié)構(gòu)與免疫基因位于同一個操縱子且是緊連的[1 ]。最初認Lantibiotics 的免疫性只與一種免疫基因有關(guān)，對尼生素是nis1 而對枯草菌素則是 Spa1，它們分別編碼 nis1 及Spal 免疫蛋白。然而，似乎這些細菌素的免疫性是幾種蛋白質(zhì)影響的結(jié)果，因為刪除可以編碼其它蛋白質(zhì)的基因?qū)⒏淖兗闹鞯拿庖咝訹12]。例如，不產(chǎn)尼生素的對尼生素有抗性的菌株Lac.lactis并不具有編碼Nis1免疫蛋白的基因單元，但含有類似于nisF、nisE 及nisG 的基因序列，而這被認為是此菌株對尼生素有抗性的原因。刪除 n is G 使得細胞對尼生素的抗性減小。對于第二類class 11)細菌素 nonlantibiotics，免疫現(xiàn)象要簡單些。它們具有一種可以編碼免疫蛋白的基因。通常，此免疫蛋白是松散地與膜結(jié)合在一起的具有50~150氨基酸殘基的堿性蛋白。乳球菌素A(Lactococcin A)免疫蛋白(Lcn1)是目前為止研究得最多的。
    2.4 抑菌性及其影響因素
    研究得較多的是尼生素的抑行?。膸V素主要抑制大部分G+ 菌的生長，包括產(chǎn)芽孢桿菌(如肉毒桿菌)、耐熱腐敗菌(如嗜熱脂肪芽孢桿菌)等。它在食品防腐中的重要價值在于能抑制芽孢細菌(包括嗜熱產(chǎn)氣芽孢菌)。由于多數(shù) G+ 菌能引起食品腐敗，有些并能導致食物中毒等危害人健康，因此尼生素作為食品防腐劑是重要的、有效的。早期的研究認為，尼生素一般對霉菌、酵母菌和G―菌無效。但近期的研究表明，在一定條件下(如冷凍、加熱、降低pH 和 EDTA 處理)，一些G ―菌如沙門氏菌、大腸桿菌、假單胞菌、擬桿菌、放線桿菌、克雷伯氏菌，對尼生素敏感。例如，尼生素的溶解性在 pH2 時比pH8 時要高228 倍。在酸性條件下，尼生素對溫度較穩(wěn)定，隨著 pH 值的增加，溫度越高，尼生素活性下降越顯著，pH6 和7 時，121℃、20min 高溫后尼生素活性完全喪失。同時，放置溫度和時間對尼生素活性也有顯著影響，放置溫度越高、時間越長，尼生素活性下降越顯著 。此外，食品的 學成分和物理狀態(tài)對細菌素的活性有巨大的影響。
    細菌素，特別是lantibiotics，是通過在膜上形成孔，耗盡跨膜電勢差(△φ)和 pH 梯度，導致細胞物質(zhì)的泄漏而抑制靶細胞。細菌素是帶疏水片段的正電荷分子，其與靶細胞膜上的帶負電荷的磷酸鹽基團的靜電相互作用被認為有助于其最初的與靶細胞膜的結(jié)合。最近的研究表明尼生素活性的復雜性在于，為了殺死細胞必需與細胞膜上的脂質(zhì) II 結(jié)合[15]。可以推測為了接近諸DNA、RNA、酶及其它位點等靶以殺死靶細胞，細菌素必需首先進入細胞。現(xiàn)在已經(jīng)證明有一種第二類細菌素可以精確地抑制喔邢婦中的細胞質(zhì)膜的形成。細菌素對不同靶細胞的作用并不相等，研究者測定了細菌素對特定的菌種及菌株的親合力，目標菌株的磷脂成分及環(huán)境的 pH 值影響 MIC 值[16]。最近有研究表明，似乎在靶細胞膜上的‘入塢分子’(docking molecules)更有利于與細菌素作用并增強細菌素的嘀菩Ч。其它細菌素也可以作用于靶細胞膜的特定位點，這些位點可質(zhì)。而這些相互作用可以提高細菌素的抑制活性。蛋白質(zhì) PAI 及乳球菌素A 都能形成不依賴于電勢的孔。乳球菌素能透過敏感細胞囊而其脂質(zhì)并不受影響。這表明一個細胞表面的類似受體的實體是必需的(如脂質(zhì)II )[15,16]。
    2.5 細菌素的毒性
    細菌素作為乳酸菌(LAB)的產(chǎn)品已經(jīng)被人們消費。急性、亞慢性及慢性的研究，以及繁殖、提高敏感性、體外的和交叉抗性的研究均表明尼在ADI(AcceptableDaily Intake )為 2.9mg/ 人 /d 時消費是安全的。包括老鼠及豚鼠試驗得知，由于尼生素是口服的，也測定了尼生素對口腔里的微生物菌群的影響，對飲用 1min之后的含尼生素的巧克力牛奶進行化驗，發(fā)現(xiàn)在唾液中尼生素的濃度活性只是最初的 1/40，控制組唾液只有 1/100 的活性。另外的研究揭示了胃酶對尼生素的影響，胰島素可使其失活，且被吸收的尼生素對有益微生物菌群沒有影響，比如腸道菌群。尼生素是當前最為商業(yè)化的細菌素，研究者對其在食品應用的安全性也作了肯定評價。
    3 細菌素在食品中的應用
    到目前為止, 細菌素中只有尼生素批準應用于食品工業(yè)。已在世界 50 多個國家和地區(qū)廣泛應用其作為食品防腐劑。雖然許多國家對其添加數(shù)量和所應用食品的范圍有所不同，但有不少國家,如英國、法國、澳大利亞等國對其添加數(shù)量則不作任何限制。我國衛(wèi)生部頒發(fā)的GB2760-86 規(guī)定，尼生素在罐裝食品、植物蛋白食品最大使用量為 0.2g/kg，乳制品、肉制品最大使用量為0.5g/kg，一般參考用量為 0.1~0.2g/kg。作為食品工業(yè)普遍使用的一種天然生物防腐劑，尼生素應用前景雖然廣闊，但也存在一定的局限性。首先，尼生素的抗菌譜較窄，只對革蘭氏陽性菌起作用，而對革蘭氏陰性腐敗菌、酵母菌、霉菌及病毒尚沒有明顯的抑制作用。
    其次，食品加工中的一些因素也會影響它的防腐效果。
    包括:(1)在貨架期內(nèi)，食品原材料中來源于微生物、動植物有機體中的蛋白酶或許會降低尼生素的活性。
    (2) 尼生素在酸性環(huán)境下熱穩(wěn)定性很高，但在中性或堿性pH
    條件下熱穩(wěn)定性較差。
    (3)因尼生素是一個疏水多肽，所以食品中的脂肪物質(zhì)會干擾它在食品中的均勻分布，從而影響它的效果。因此，尼生素在液體和均一性的食品中防腐效果較好，在固體和異質(zhì)性食品中的效果相對要差。
    (4) 尼生素能夠與許多化學食品防腐劑，如山梨酸等配合使用，進而有更好的防腐作用，但某些食品添加劑(如焦亞硫酸鈉、二氧化鈦)對尼生素的活性有負面影響，導致尼生素的降解。
    (5)研究表明，在食品貨架期內(nèi)尼生素的應用效果與它<殘留量有直接關(guān)系，而它的殘留量則取決于貯藏溫度、貯藏時間和貯藏食品的pH 值，所以，依據(jù)不同的食品來確定尼生素在保存期內(nèi)的殘留量是保證尼生素應用效果的一個重要指標?？傊?應用尼生素作防腐劑時，既要考慮其優(yōu)越性又要考慮其局限性，才能達到更好的效果。
    3.1 在乳制品中的應用
    尼生素已成功應用于硬質(zhì)干酪、巴氏滅菌干酪、巴氏滅菌奶、罐裝濃縮牛奶、高溫滅菌奶、高溫處理風味奶、酸奶、乳制甜點等制品中。在干酪的加工過程中尼生素是最有效的保護劑，干酪原料經(jīng)80~100℃巴氏消毒后，梭菌芽孢仍能存活，乳酪中的微生物為丁酸梭菌，酪丁酸梭菌，生孢梭菌，尤其是肉毒梭菌在加工的乳酪中產(chǎn)生毒素。Taylors 等研究表明，在經(jīng)巴氏處理的干酪中加入500~1000IU/ml 尼生素能阻止梭的生長和毒素的形成，同時還能降低食鹽和磷酸鹽的用量。酸奶中主要污染菌為霉菌、酵母菌和細菌圓捎500IU 尼生素/ml 和耐酸CMC、復合穩(wěn)定劑A 或B，可延長酸奶的保質(zhì)期4~8d，且不影響酸奶的感官和品質(zhì)[16]。
    3.2 在酸性罐頭食品中的應用
    在酸性條件下，尼生素的穩(wěn)定性、溶解度、活性均提高，因而它可成功地應用于高酸性食品(pH ＜4.5)的防腐。低酸或非酸性罐頭食品添加了尼生素，也能起到減輕熱處理強度的作用。錢平等采用沸水殺菌和添加尼生素相結(jié)合的方式，對蔬菜罐頭進行殺菌，結(jié)果表明，經(jīng)過處理的罐頭感官特性大為改善。張曉東等通過實驗證明，尼生素作為一種天然食品防腐劑應用于瓶裝醬菜，能夠降低醬菜中食鹽用量,效果優(yōu)于化學防腐劑苯酸鈉和山梨酸鉀。它能有效地抑制乳酸菌再發(fā)酵和葡萄球菌、芽胞菌的生長繁殖。尼生素安全性可靠，尼生素的 LD50 值與食鹽相當。由于某些國家在食品中不準使用苯甲酸鈉，所以尼生素用于瓶裝醬菜出口，具有現(xiàn)實意義。添加尼生素的瓶裝醬菜其衛(wèi)生質(zhì)量符合國家標準,并對產(chǎn)品風味無影響。也可以將其應用于復合薄膜包裝醬菜中[。
    3.3 在啤酒中的應用
    由于啤酒含有豐富的營養(yǎng)成分，pH 較低，氧含量低，含糖量較少，加之啤酒中含有酒精，所以啤酒中腐敗菌主要是乳酸菌。乳酸菌屬的乳酸桿菌和片球菌是啤酒加工過程中最常見的污染菌，是啤酒發(fā)酵中最需要防治的有害微生物。對于尼生素在啤酒行業(yè)中的應用，英國學者做了大量的實驗，他們認為尼生素能夠提高啤酒的生物穩(wěn)定性。尼生素對于生長和發(fā)酵階段的啤酒酵活力、凝聚力和釀造特性沒有影響，啤酒低 pH、酒花物質(zhì)的環(huán)境下，尼生素活性不受影響，但是卻幾乎能夠有效的抑制啤酒中已發(fā)現(xiàn)的所有的革蘭氏陽性腐敗菌，從而提高啤酒的生物穩(wěn)定性。1985 年，Ogden等用平板打孔法檢測得出，啤酒常見腐敗菌幾乎均能被100IU/ml 尼生素所抑制。尼生素能夠抑制啤酒釀造過程中某些害微生物的生長，可以應用于啤酒釀造的不同階段[ 18 ]。
    3.4 細菌素在肉制品中的應用
    由于乳酸菌(LAB)通常在肉制品中發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)能從這些細菌中生產(chǎn)細菌素。雖然大多數(shù)細菌素已經(jīng)從與食品有關(guān)的乳酸菌(LAB)中分離出來，它們并不定對所有的食品都有效。當然，在適當?shù)臈l件下許多細菌素有可能應用于食品。其中研究得最多的是尼生素在肉制品中的應用。硝酸鹽通常被用來抑制肉制品中梭菌的生長。然而，對安全性的關(guān)注促使食品工業(yè)去尋找其它可供選擇的保存手段，尼生素單獨或與低濃度硝酸鹽混合可以抑制 Clostridium 的生長。一個常用的試驗系統(tǒng)是香腸，因為其腐敗常是由可以被細菌素抑制的乳酸菌引起的，Davies 等研究了脂肪含量及磷酸鹽乳化劑對香腸中尼生素的抗菌效果的影響，發(fā)現(xiàn)體系中低脂肪含量對應于高的尼生素活性。另外一些研究將尼生素與乳酸混合使用，結(jié)果表明對 G－細菌具有更高的抑制效果。
    我國是一個乳酸菌等細菌資源豐富的國家，但是，對天然、無毒、安全的食品防腐劑―細菌素的研究起步較晚，因此，要加大力度對細菌素的基礎(chǔ)研究和應用研究，堅信細菌素作為一類具有廣闊開發(fā)應用前景的天然食品防腐劑，將對人類健康有著實際意義。

作者：廣西大學輕工與食品工程學院 劉 ，楊 洋